M-MLV?逆轉錄酶

產(chǎn)品說明

M-MLV逆轉錄酶是由一個?71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉錄聚合酶?？梢源呋訰NA或DNA：RNA雜交鏈為模板的互補DNA?的聚合反應。本酶經(jīng)修飾RNase H活性比普通的逆轉錄酶要弱很多，因此在合成第一鏈cDNA的過程中，可保證RNA的降解程度較低，從而使得率提高。

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產(chǎn)品組分

R1041可進行25次逆轉錄反應，R1042可進行50次逆轉錄反應（20 μl?標準?PCR?反應體系，每次使用?M-MLV 1 μl）。

M-MLV?儲存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，200 mM NaCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.01% NP-40，50% glycerol

5x first-strand buffer?成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，375 mM KCl，15 mM MgCl₂，50 mM DTT

保存條件

-20℃保存，避免反復凍融。

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質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[₃₂P]dCTP作為標記，200 U的M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA為模板進行逆轉錄反應，最低可得到120 ng的cDNA，所得cDNA長度?>?全長的90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50 ng的標記DNA或RNA與200 U M-MLV在1×反應緩沖液體系中，37℃溫浴1 h，檢測DNA和RNA降解都不到總量的1%。

核酸內切酶活性檢測

混合1μgⅠ型超螺旋質粒DNA與500 U M-MLV在1×反應緩沖液體系中，37℃溫浴1 h，瓊脂糖電泳檢測，無明顯的剪切。

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適用范圍

第一鏈cDNA?合成；cDNA?文庫構建；RT-PCR；引物延伸；3'?和?5' RACE。

注意事項

l??成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長的完整性并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或?SDS。用于cDNA合成反應的溶液試劑盡可能用DEPC進行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時，首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進行過濾除菌處理。

l??為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存?RNA?的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2 M同時加入4倍體積的乙醇，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離心5 min。

l??在逆轉錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑（RNasin）以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。在第一鏈合成反應中，RNase抑制劑在緩沖液和還原劑（如?DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C?對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了RNase抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

l??較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加反應的產(chǎn)量。

l??使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應的RNA，但為了保證實驗的成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸胍法）制備的高純度RNA。

l??為防止RNA降解，應盡量避免反復凍融，最好保存于-70℃。

l??最佳的PCR反應條件，因PCR擴增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應，以確定最佳的PCR反應條件。

l??cDNA產(chǎn)物應置于-20℃保存。

l??當以cDNA為模板進行PCR之前，使用RNase H處理cDNA，可以提高PCR反應的靈敏度。

操作步驟

1?在冰浴的無菌離心管中配制下列混合物

2?進行變性退火反應

70℃溫浴5 min，簡短離心后冰浴5 min。

3?在上述離心管中配制反轉錄反應液

4?按下列條件進行反轉錄反應

Oligo (dT)₁₅?：42℃溫浴60 min；

Random primer：?37℃溫浴60 min。

5?終止反應

70℃溫浴5 min終止反應，置冰上進行后續(xù)實驗或-20℃保存。

6?用RNase-free ddH₂O將反應體系稀釋到50μl，取2-5μl進行PCR擴增反應。