通用菌落PCR檢測試劑盒
Cat. #：P8011，P8012
產品簡介
本試劑盒利用PCR原理，結合本公司的快速DNA聚合酶（延伸速率20s/kb），設計適用性廣的最佳引物，優(yōu)化PCR反應緩沖體系，同時簡化檢測方法，可用于各種常用T載體克隆的篩選檢測。
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產品組成
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Component |
P8011 |
P8012 |
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2× FSTM?Mix |
500 μl |
1 ml × 5 |
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T-primer (10 μM) |
50 μl |
500 μl |
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超純水 |
1 ml |
1 ml × 10 |
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說明書 |
1份 |
1份 |
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活性定義
一個活性單位（U）指用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在72℃、30 min內，攝入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
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保存條件
-20℃保存。
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質量控制
純度檢測：經(jīng)質量檢測，產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能檢測：PCR方法檢測本試劑盒無宿主殘余DNA，也無其他DNA污染，能有效完成PCR擴增。
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應用舉例
1.?準備樣品
將過夜培養(yǎng)的平板上的菌落編號后，用滅菌的牙簽挑取單克隆菌體的一部分至反應體系中；或在1.5 ml EP管中分裝500 μl含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基，并做好標記，用無菌牙簽提取單個菌落至上述培養(yǎng)基中，37振蕩（250-300rpm）培養(yǎng)4h，取1-2 μl菌液用于擴增。
2.?配制反應體系
請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調整：
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Ordinal |
Component |
Volume (20 μl reaction volume) |
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1 |
2× FSTM?? Mix |
10 ? μl |
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2 |
T-primer (10 μM)* |
1 μl |
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3 |
菌體或菌液 |
1 μl |
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4 |
超純水 |
To ? 20 μl |
*包含了上下游引物，擴增大小約為：克隆片段+250 bp。
●?加入各組分后，請用槍頭反復吸吹幾次，充分混勻。
●?在一次配制多管需分裝時建議按（n+1）的反應液量配制，以確保分配時的耗損不會影響實驗，同時選擇大于總體積的離心管便于混勻。
●?如需使用其他體積的PCR反應體系，請按各組分比例縮減或增加各組分用量。
●?將混勻的各管短暫離心，置于PCR儀中。
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3.?設定反應程序進行PCR反應
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Stage ? |
Temperature |
Time |
Number ? of Cycles |
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Initial ? Denaturation |
94℃ |
3 ? min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 ? sec |
30 |
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Annealing |
55℃ |
30 ? sec |
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Extension |
72℃ |
30 ? sec or 45 sec |
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Final ? Extension |
72℃ |
5 ? min |
1 |
●?設定PCR程序時，請根據(jù)目的片段大小決定延伸時間，如果目的片段大小為500 bp時，延伸時間為15 sec；500 bp-1 kb，延伸時間20 sec；目的片段>1 kb時，延伸時間按20s/kb計算。
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3.?分析結果
反應結束后取2-5 μl反應產物與loading buffer混勻后進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。
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注意事項
請嚴格按照說明書提供的實驗體系及實驗條件進行試驗。
室溫下DNA聚合酶有一定的活性，為避免發(fā)生非特異性擴增，請于冰上配置反應體系，并且最后添加FSTM?Mix或模板DNA。
挑取菌落時，應選擇單菌落，不要挑取太多菌體，以免影響PCR結果。
部分適用T載體參考下表：
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公司 |
T載體 |
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Promega |
pGEM-T ? Vector |
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pGEM-T ? Easy Vector |
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Takara |
pMD18-T ? Vector |
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pMD19-T ? Vector |
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pMD20-T ? Vector |
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pMD18-T ? Simple Vector |
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pMD19-T ? Simple Vector |
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pSIMPLE-18 ??EcoR?V/BAP Vector |
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pSIMPLE-19 ??EcoR?V/BAP Vector |
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Tiangen |
pGM-T載體 |
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pBS-T載體 |